（1）阳性着色细胞计数法。 在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

（2）灰密度分析法。 通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

（3）评分法。 通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，用来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，比如donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

（2）两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

（3）阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

（4）封闭血清与二抗来源动物一致，用的是10%的正常donkey血清。

（5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作

您可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 其他按步骤即可。